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应用rnai技术沉默nf-κb基因的实验性研究.docx


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应用rnai技术沉默nf-κb基因的实验性研究.docx
文档介绍:
应用RNAi技术沉默NF.xB基因的实验性研究
摘要
目的
设计并筛选到针对NF—rB/p65(relA)的RNA干扰的最有效靶点。构建重组腺病毒,感染小鼠成肌细胞并表达设计的siRNA,通过RNA干扰(RNA interference,RNAi)作用,沉默NF.rB/p65基因,抑制NF-rB/p65的表达。探讨对致炎因子生成的影响,为进一步研究实验性类风湿性关节炎提供理论依据。
方法根据Ambion公司提供的软件,按照RNAi的设计原则,设计3个
NF—xB/p65的干扰靶点,并据设计相应的短发夹结构的RNA(short hairpin RNA,shRNA)合成相应RNA的DNA模板,通过T4连接酶,将这些 DNA分别插入shuttle vector 1.0 CMV质粒中形成3种重组质粒。用脂质体法将重组质粒分别转染入小鼠成肌细胞(C2C12)。通过RT-PCR方法比较各mRNA 的转录水平,进而筛选出沉默效果最好的表达质粒。用所选出的重组质粒与腺病毒骨架(Adenoviral lacZ Backbone)线性化后共转染293细胞得到重组腺病毒。用重组腺病毒感染C2C12细胞检测其感染的效果。
结果
shRNA的DNA模板成功插入到shuttle vector 1.0 CMV表达质粒,形成重组质粒,重组质粒转入C2C12细胞并筛选出沉默效果最好的质粒。筛选出的重组质粒与腺病毒共转染293细胞构建了重组腺病毒。重组腺病毒感染了C2C12 细胞。
结论
设计的shRNA的DNA模板可以插入到shuttle vector 1.0 CMV表达质粒,形成重组质粒,重组质粒可由脂质体法转入C2C12细胞,并能够有效的抑制C2C12的NF.K B/p65的mRNA的表达。
关键词类风湿性关节炎(RA);RNAi;重组质粒;重组腺病毒;基因治疗; 成肌细胞(C2C12)
Inhibition of NF—KB gene expression by RNA interference
Abstract
objective
To inhibit the expression of NF-rd3/p65 gene by RNA interference,the NF-r,B/p65 targets of RNA interference were designed and selected,and the binant adenovirus with the selected plasmid was constructed.Then we plan to research the effect of inflammation factors and some cell factors by this RNAi in vitro.We hope
take some mechanism of therapy.RA.
Methods
The 3 targets of NF·1cEI/p65 and control sequence were designed in the web of Ambion corporation according to the rule of design siRNA.And the plasmids Shuttle Vector 1.0-CMV with the design sequences of NF—r.B/p65 were bined.So the binant plasmid can express the shRNA of NF-r.B/p65.After the binant plasmid transfected the C2C1 2 cells by liposome,RT-PCR assay was used to determine the mRNA expression of NF—r.B/p65.which can help to select a plasmid with the most effective RNAi.The binant adenovirus with the selected plasmid and the control plasmid were constructed and infected the C2C1 2 cells.
Results
The binant plasmids of shuttle vector 1.0 CMV expressing shRNA targeting NF—r,B/p65 have been constructed.and the one with the most effective RN 内容来自淘豆网www.taodocs.com转载请标明出处.
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